機械的ストレス下にあるRANKL+老化細胞：老化細胞破壊を利用した歯科矯正の歯根吸収の治療標的

International Journal of Oral Science volume 15、記事番号: 20 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

歯科分野において、歯列矯正の歯根吸収は長期にわたる問題であり、効果的な治療戦略はなく、そのメカニズム、特に老化細胞に関連するメカニズムはほとんど不明のままです。今回我々は、ラットのLループを備えた歯科矯正用貫入歯の移動モデルを用いて、機械的ストレス誘発性老化細胞が根尖根吸収を悪化させるが、老化細胞破壊薬（ダサチニブとケルセチンのカクテル）の投与により抑制されることを実証した。我々の結果は、セメント芽細胞と歯周靱帯細胞が細胞老化（p21+またはp16+）を起こし、3日目から核因子カッパB受容体活性化因子（RANKL）を強く発現し、その後酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）陽性象牙細胞を誘導し、根尖吸収。 p16+老化細胞よりもp21+老化細胞の方がRANKLを発現していた。 RANKL+ 非老化細胞の数にはわずかな変化しか観察されませんでしたが、RANKL+ 老化細胞は 7 日目から顕著に増加しました。興味深いことに、根の吸収窩にはカテプシン K+p21+p16+ 細胞も見つかり、老化した象牙細胞を示唆しています。ダサチニブとケルセチンを経口投与すると、これらの老化細胞とTRAP+細胞が著しく減少し、最終的には根の吸収が軽減されました。まとめると、これらの結果は、歯列矯正による侵入歯の移動が誘発するRANKL+早期老化細胞における異常な刺激が、歯細胞形成とそれに続く歯根の吸収において極めて重要な役割を果たしているということを明らかにしている。これらの発見は、歯科矯正による歯の移動中の歯根の吸収を防ぐための新しい治療目標を提供します。

歯科矯正治療中の根の吸収は、一般に矯正歯科医を悩ませます。たとえば、以前のいくつかの研究では、歯根吸収の発生率は 90% および 100% に達しました 1。さらに、中程度から重度の根尖端の吸収は歯科矯正患者の 12% ～ 17% で発生し、場合によっては意図しない臨床副作用を引き起こすことがあります。、歯の喪失.2 それにもかかわらず、現時点では効果的な予防療法はありません。したがって、新たなメカニズムに基づいてベールに包まれた治療標的を探索することが必要である。

根の吸収は、非生理学的細胞活性化と多数の細胞の動員のオーケストラの根底にある複雑なメカニズムです。3 骨吸収に関連する破骨細胞と同様に、象牙細胞が出現して根の表面を吸収します。4,5 核因子カッパ B の受容体活性化因子リガンド (RANKL)/RANK 関連経路は、象牙細胞および破骨細胞形成の誘導と活性化を強力に促進する古典的な経路の 1 つです。3 セメント芽細胞や歯根膜 (PDL) 細胞などのさまざまな細胞型がこのリガンドを発現します。6、7さらに、炎症、活性酸素種 (ROS)、非生理学的機械的ストレスなど、複数のストレス因子が RANKL 発現を促進します。8,9 たとえば、ヒト不死化セメント芽細胞株と PDL 細胞はストレス下で RANKL を顕著に発現します。10,11 、12、13、14 歯科矯正による歯の移動（OTM）はセメント芽細胞を活性化してRANKL発現を誘導します。15、16 したがって、破骨細胞形成と歯細胞形成の類似点を考慮すると、17 骨粗鬆症治療薬（例えば、直接的な細胞死を引き起こす二リン酸塩やデノスマブなど）破骨細胞の形成を防ぐ抗 RANKL 抗体）は、根の吸収を治療するためにのみ研究されてきました 18,19。しかし、これまでのところ、これらの薬剤はまだ臨床応用には至っていません。

老化した細胞では細胞老化は避けられず、その結果、不可逆的な増殖停止、強力な分裂促進シグナル、テロメアの短縮、DNA 損傷、および in vitro および in vivo での ROS の増加が引き起こされます 20,21。特に、DNA 損傷は、ストレス誘発性早産症において重要な役割を果たします。機械的、酸化的、放射線、遺伝毒性物質などのさまざまなストレス因子によって引き起こされる老化。22、23、24、25 歯科においても、エタノール誘発細胞老化がセメント芽細胞や歯根膜細胞で報告されています。26 他の研究者も同様に報告しています。は、セメント芽細胞が機械的ストレス刺激に応答して細胞老化と石灰化阻害を受けることを実証しました。 27 老化細胞は一般に、細胞周期抑制に関与する経路である p53/p21CIP1 や p16INK4A/RB などの転写因子カスケードを活性化します。 28,29 したがって、p21および p16 は老化細胞を検出するためによく使用されるマーカーです 30,31 さらに、細胞老化研究の急速な進歩により、老化細胞がさまざまな加齢関連疾患に関与し、炎症性物質を含む老化に関連する分泌表現型を分泌することによって寿命に影響を与えることが明らかになりました 32。周囲の組織を損傷します33。

2015年、ダサチニブ（チロシンキナーゼ阻害剤、慢性骨髄性白血病の治療に使用）とケルセチン（植物由来のフラボノイド）で構成される薬剤のカクテルが、老化細胞に対する特異的な細胞死誘導剤（すなわち、老化細胞破壊薬）として同定された。 (以下、ダサチニブとケルセチン [D+Q])。34 それ以来、その有効性は、糖尿病、アルツハイマー病 35、骨粗鬆症 36 などのさまざまな疾患や骨再生の回復に対して確認されています。 37 臨床実現可能性試験と開発その結果、老化細胞は現在、さまざまな疾患の治療標的として認識されています。20 したがって、老化細胞は根の吸収を防ぐための潜在的な治療標的です。それにもかかわらず、OTM下での老化細胞の会合と局在化、および根の吸収におけるそれらの機能についてはほとんど知られていない。

今回我々は、Lループを備えた歯科矯正用貫入歯移動モデルを用いて、OTMによる有害な機械的ストレスがRANKL陽性（RANKL+）老化セメント芽細胞とPDL細胞を誘導し、ラット臼歯の歯根吸収を悪化させることを示す。さらに、D + Qを経口投与するとRANKL +老化細胞の数が著しく減少し、根の吸収が弱まることが確認され、機械的ストレス誘発性の老化細胞が根の吸収療法の潜在的な標的であることが示されました。

根尖根の吸収を模倣するために、我々はまず、図1および2に示す垂直下向きのLループを備えたラットOTMモデルを確立しました。 1a、b. L ループは、歯を予測どおりに動かすために必要な力とモーメントを生成する、歯科矯正治療で使用される従来の装置です。その結果、力は機械的応力として心尖部およびＰＤＬ組織に直接伝播する。上顎左第一大臼歯（M1）に、垂直下向きに機械的な力（5 N）を 14 日間継続的に加えました（図 1c、d）。 Lループ処理を行わなかったラットを対照群として使用しました（図1c、図S1）。マイクロコンピューター断層撮影（μ-CT）分析では、14日後に対照群では歯の動きが見られませんでしたが（図S1a）、Lループでは5日目以降にM1が垂直下方に大きく移動しました。これは、OTMが機械的力と機械的力を引き起こすことに成功したことを示しています。根尖周囲組織へのストレス (図 1d、e)。

ラットの歯科矯正歯の侵入モデル。 a 矯正歯の移動 (OTM) モデル上の L ループ力システムの概略図。青い横線: 不活性化段階の L ループ脚。 Lループ脚部に樹脂を用いて垂直方向の力（5N：赤矢印）を加えた後、てこの効果（赤丸）により左側のM1に垂直方向の力（緑矢印）が加わります。 M1：第一大臼歯、M2：第二大臼歯、M3：第三大臼歯。 b L ループを備えたモデルの頬側 (左) と正面側からの肉眼画像 (低倍率と高倍率: それぞれ中央と右の画像)。 c 動物実験のフローチャート (グループあたり n = 4)。 D ダサチニブ、Q ケルセチン。 d 左上顎大臼歯の再構成マイクロコンピュータ断層撮影 (μ-CT) 画像。白線: M1 の OTM 距離を測定するためのベースライン。黄色の双方向矢印: M1 の先端から基本線までの距離。 e (d) からの OTM 距離の定量分析。平均値 ± 標準偏差として表されます。 ****P < 0.000 1; ns は重要ではありません

続いて、OTM モデルが根の吸収を引き起こす可能性があるかどうかを調査するために、μ-CT と象牙細胞検出のための酒石酸耐性酸性ホスファターゼ (TRAP) 染色を含む組織学的染色を使用して M1 の近心根の頂点を評価しました。高解像度μ-CTおよび三次元（3D）再構成画像により、根尖根表面の形態が時間依存的に変化し、応力下で不規則になることが明らかになりました（図2a）。さらに、μ-CT定量分析は、平均根尖根ミネラル密度（RMD）がストレス5日目から大幅に減少したことを示しました（図2c）。 TRAP染色では、対照群の象牙細胞（つまりTRAP+細胞）は同定されませんでした（図S1b）。しかし、OTM グループでは、数は少ないものの、ストレス 3 日目から歯細胞が歯根表面に出現しました (図 2b、黒い矢印)。対照的に、より多くの破骨細胞（TRAP+細胞：図2b、e、黒い矢印）がストレス3日目から歯槽骨表面に出現しました。歯根細胞は、歯根吸収の開始と同時にストレス5日目から急速に増加しました（図2b、d））。ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色画像は、重度の根の吸収がストレス7日目から14日目まで根尖で起こったことを示しました（図2b、白い矢印）。

機械的ストレスを受けたラットの歯における根尖根の吸収。左上顎第一大臼歯の近心根尖のμ-CT画像と三次元再構成画像。 b 機械的ストレスを加えた後の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）およびヘマトキシリン・エオシン染色の近心根画像。黒矢印:TRAP+象牙細胞。黒い矢印: TRAP+ 破骨細胞。腹部歯槽骨。白い矢印: 歯根吸収窩。 c 近心根頂部の根ミネラル密度（RMD）。 d 根の表面上の TRAP+ 象牙細胞数。 e 歯槽骨表面上のTRAP+破骨細胞数。データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 **P < 0.01、***P < 0.001、ns は有意ではありません。スケールバー: (a) では 100 μm、(b) では 250 μm。番号なし

機械的ストレス刺激は、セメント芽細胞および PDL 細胞の細胞老化を誘導し 26,27、根の吸収に潜在的に関連する RANKL 発現を上方制御します 40,41,42。したがって、免疫蛍光染色を使用して、老化マーカー（p21およびp16）およびRANKLを発現するセメント質付着タンパク質（CAP）陽性細胞の局在を検証しました（図3a、4a、およびS2a）。さらに、Ki-67（よく知られた増殖マーカー）とTUNEL染色（DNA損傷とアポトーシスの検出に使用可能）を使用して、細胞の老化とDNA損傷を確認しました（図S3およびS4）。セメント芽細胞と PDL 細胞は CAP を分泌します。したがって、それらを識別するために CAP が使用されました。 43,44,45,46 以下、根表面の CAP+ 細胞をセメント芽細胞と定義し、PDL 内の CAP+ 細胞を PDL 細胞と定義します。

機械的ストレス下にある根尖周囲組織のRANKL+細胞とp21+老化細胞。 a 免疫蛍光染色と、根尖周囲組織における 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) 対比染色下の、セメント質付着タンパク質 (CAP) および核因子カッパ-B リガンド受容体活性化因子 (RANKL) と p21 の共局在機械的ストレスを加えます。核: 青 (DAPI)。キャップ: 緑; ランクル：白。 p21: 赤。スケールバー: 低倍率と高倍率でそれぞれ 100 μm と 25 μm。 (a) の白い矢印とオレンジ色の破線は、歯根吸収窩領域を示します。 PDL歯根膜。 a1 根吸収窩の蛍光反応性細胞。スケールバー：10μm

機械的ストレス下にある根尖周囲組織のRANKL+細胞およびp16+老化細胞。 a 機械的ストレスを加えた後の根尖周囲組織におけるDAPI対比染色下での免疫蛍光染色およびセメント質付着タンパク質(CAP)およびRANKLとp16との共局在。核: 青 (DAPI)。キャップ: 緑; ランクル：白。 p16: 赤。スケールバー: 低倍率と高倍率でそれぞれ 100 μm と 25 μm。 (a) の白い矢印とオレンジ色の破線は、歯根吸収窩領域を示します。 PDL歯根膜。 a1 根吸収窩の蛍光反応性細胞。スケールバー：10μm

図３〜５、図Ｓ１ｃおよびＳ２ａは、根尖周囲組織におけるＣＡＰ、ＲＡＮＫＬ、ｐ２１、またはｐ１６を発現する細胞の時空間分布および定量化された数を示す。対照群では、RANKLまたはp21を発現するセメント芽細胞およびPDL細胞は、OTMなしで14日後に観察されませんでした（図S1c）。対照的に、RANKL+、p21+、およびp16+細胞は、機械的ストレス下で根尖周囲組織に出現しました（図3、4、および図S2a）。増殖細胞の数は、p21マーカーの増加と並行して減少しました（図S3）が、機械的ストレス下ではDNA損傷細胞（TUNEL +細胞）が増加しました（図S4）。 RANKL+セメント芽細胞およびRANKL+PDL細胞(すなわちRANKL+CAP+)はストレス3日目から出現し、ストレス5日目および7日目に顕著に増加した(図5a)。同様に、老化セメント芽細胞およびＰＤＬ細胞（ｐ２１＋ＣＡＰ＋細胞またはｐ１６＋ＣＡＰ＋細胞）は、ストレス３日目から７日目まで増加した（図５ｂ、ｃ）。セクションが異なるため、p21+ 細胞と p16+ 細胞の絶対数を直接比較することはできませんでしたが、セクションごとの統計的差異を考慮すると、p21+ 細胞の数は p16+ 細胞よりも早く増加したと結論付けることができます。これらの老化細胞の中で、根尖周囲組織でRANKL+セメント芽細胞とPDL細胞を発見しました（図3および4）。図 3a1 および 4a1 は、根吸収窩内の代表的な RANKL+ 老化セメント芽細胞を示しています。

根尖周囲組織における老化(p21+またはp16+)またはRANKL+セメント芽細胞およびPDLの割合を分析しました。 a 根尖周囲組織内の RANKL+ セメント芽細胞または RANKL+ PDL 細胞の数。セメント芽細胞: 根の表面の CAP+ 細胞。 PDL セル: PDL の CAP+ セル。 b、c 根尖周囲組織内の p21+ または p16+ セメント芽細胞または PDL 細胞の数。データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.000 1、ns は有意ではない。番号なし

機械的ストレス下でのセメント芽細胞またはPDL細胞（CAP+細胞）の特性を分析するために、老化マーカー発現（p21およびp16）およびRANKLに基づいて各細胞をさらに分類しました（セメント芽細胞およびPDL細胞についてそれぞれ図6および7）。老化セメント芽細胞（p21+またはp16+;図6a〜cの破線の赤丸）では、RANKL+細胞はストレス7日目まで時間の経過とともに増加しましたが、RANKL-細胞にはわずかな変化しかありませんでした（図6b、c）。これらの結果は、ほとんどの老化セメント芽細胞がRANKLを発現していることを示唆しています。一方、老化PDL細胞（p21+またはp16+、図7a〜cの破線の赤丸）では、RANKL+およびRANKL-老化細胞はストレス7日目まで同様に増加しました。上記の違いの理由は解明できませんでしたが、これらの結果はは、老化セメント芽細胞と PDL 細胞が根尖周囲組織の機械的ストレスに応答して RANKL を敏感に発現することを実証しています。

歯科矯正による歯の移動（すなわち、機械的ストレス）下での根尖周囲組織におけるRANKL+または老化セメント芽細胞の分類。 a 機械的ストレス下におけるRANKL+または老化セメント芽細胞の概略図。赤い破線の円: (b) および (c) の RANKL を発現または発現していない老化細胞。青い破線の円: (d) および (e) の老化マーカー (p21 または p16) を発現または発現していない RANKL+ 細胞。 b、c 老化セメント芽細胞におけるRANKL発現（p21+/CAP+/DAPIまたはp16+/CAP+/DAPI）。 d、e RANKL+セメント芽細胞（RANKL+/CAP+/DAPI）における老化マーカー（p21またはp16）の発現。データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.000 1、ns は有意ではない。番号なし

歯科矯正による歯の移動（すなわち、機械的ストレス）下での根尖周囲組織におけるRANKL+細胞または老化PDL細胞の分類。 a 機械的ストレス下にある RANKL+ 細胞または老化 PDL 細胞の概略図。赤い破線の円: (b) および (c) の RANKL を発現または発現していない老化細胞。青い破線の円: (d) および (e) の老化マーカー (p21 または p16) を発現または発現していない RANKL+ 細胞。 b、c 老化 PDL 細胞における RANKL 発現 (p21+/CAP+/DAPI または p16+/CAP+/DAPI)。 d、e RANKL+ PDL 細胞（RANKL+/CAP+/DAPI）における老化マーカー（p21 または p16）の発現。データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 **P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.000 1、ns は有意ではない。番号なし

次に、RANKL+セメント芽細胞中の老化（p21+またはp16+）細胞の割合を分析しました（図6a、d、eの青い破線の円）。 p21- 細胞と p21+ 細胞の数はストレス 5 日目までは差がありませんでしたが、ストレス 7 日目から p21+ 細胞が顕著に増加しました (図 6d)。一方、ストレス 14 日目までは、p16+ 細胞の数は一貫して p16- 細胞の数よりも少なかった。注目すべきことに、p21 は早期老化メーカーとして知られているため、p21- 細胞は非老化細胞を表す。47 ただし、p16- 細胞はこれらには p21+ 初期老化細胞も含まれるため、必ずしも非老化細胞であるとは限りません。 p21 と p16 の発現は老化後期に重複します。47 機械的ストレス下における老化 PDL 細胞の傾向は、老化セメント芽細胞の結果と一致しています (図 7d、e)。まとめると、RANKL は非老化細胞や p16+ 細胞ではなく、主に p21+ 老化細胞で発現していました。

歯細胞が細胞老化を起こしたかどうかを調べるために、歯細胞マーカー (カテプシン K) に対する抗体を使用して根尖周囲組織の切片を老化マーカー (p21 および p16) で染色しました。興味深いことに、14日目の根吸収窩ではカテプシンK + p21 + p16 +多核細胞が見つかりました（図8およびS2b）が、ストレスフリーグループでは見つかりませんでした（図S5）。

根吸収窩の老化歯牙細胞。 14日間の機械的ストレス後のカテプシンK、p21、p16、およびDAPIで染色した根の吸収部位の免疫蛍光画像。核: 青 (DAPI)。カテプシンK：白色。 p21: 赤。 p16: 緑。スケールバー = 低倍率と高倍率でそれぞれ 100 μm と 25 μm。白い矢印とオレンジ色の破線は歯根吸収領域を示します。腹部歯槽骨

歯根吸収に対するRANKL+老化セメント芽細胞とPDL細胞の機能を明らかにするために、機械的ストレス下で1日目と7日目に老化細胞破壊薬（D + Q）をラットに経口投与しました（図1c）。老化細胞破壊用量は以前の研究から定義されました48。RANKL+老化（p21+またはp16+）細胞とカテプシンK+p21+p16+細胞の数は、D + Qグループ（図9a、b、およびS6）では根の表面から大幅に減少しました。 Ki67+ 細胞 (増殖細胞) の数は回復しましたが、TUNEL+ 細胞 (アポトーシス細胞) は増加しました (図 S3 および S4)。セメント芽細胞およびＰＤＬ細胞の総数も根尖周囲組織で減少した（図９ｃ）。さらに、TRAP + 細胞およびカテプシン K + p21 + p16 + 多核細胞は根の表面から大幅に減少しました（図 9d、f、および S6）。しかし、老化細胞が減少し（図S6）、いくつかの部分で共局在していたにもかかわらず、歯槽骨上のTRAP +およびカテプシンK +（ただしp21 + p16 +）細胞は依然として同定されました（図9dおよびS6）。機械的ストレス下の破骨細胞近く（図S7）。 3D 再構成と定量分析を備えた高解像度 µ-CT 画像により、D+Q を投与した場合、D+Q を投与しなかった場合よりも根の表面が滑らかになっていることが判明しました。根尖近位部の RMD は、D+Q 群の方が D+Q 投与群よりも高かったです。 D + Qのないグループ（図9e、f）。 D+Q投与後の歯の移動は約50％に減少しました（図10）。この結果は、老化細胞破壊薬の経口投与がRANKL+老化細胞を除去することにより、機械的ストレス下で起こる根の吸収を効果的に軽減することを示している（図11）。一方、この治療法を臨床使用に進めるには、さらなる詳細な解明と慎重な改善が必要である。

老化細胞破壊薬の経口投与により、根の吸収が防止されました。ラットをダサチニブ (D) + ケルセチン (Q) で治療するか、14 日間の歯科矯正歯の移動 (すなわち機械的ストレス) 中の 1 日目と 7 日目に未治療のまま放置しました。 a CAP、RANKL、p21、p16、および DAPI で染色された根尖周囲組織の免疫蛍光画像。核：青（DAPI）、RANKL：白。キャップ: 緑; p21またはp16：赤。スケールバー = 低倍率と高倍率でそれぞれ 100 μm と 25 μm。 b 根尖周囲組織内のRANKL+p21+セメント芽細胞およびPDL細胞、またはRANKL+p16+セメント芽細胞およびPDL細胞の数。 c 根尖周囲組織のセメント芽細胞および PDL 細胞 (CAP+ 細胞)。 d 近心根尖のTRAP染色およびμ-CT画像。スケールバー: μ-CT 画像の場合は 100 μm、TRAP 染色の場合は 250 μm。 e 左上顎第一大臼歯の近心根尖の三次元再構成画像。 f 根尖のTRAP+細胞の数と近心根尖の根ミネラル密度（RMD）。データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 *P < 0.05、**P < 0.01、****P < 0.000 1. 番号なし

14日目のD + Q投与ありまたはなしの歯の移動。14日間の歯科矯正歯の移動（すなわち機械的ストレス）中の1日目と7日目にラットをD + Qで治療するか、または未治療にしました（図1c）。 a 左上顎大臼歯の再構成μ-CT画像。白線: M1 の OTM 距離を測定するためのベースライン。黄色の双方向矢印: M1 の先端から基本線までの距離。スケールバー: 1 mm。 b OTM 距離の定量的分析。データは平均値 ± 標準偏差として表されます。 ****P < 0.000 1

歯科矯正後の歯の移動後のダサチニブとケルセチンを使用した歯根吸収予防を示す概略図

OTMで根尖周囲にRANKL+老化細胞とTRAP+象牙細胞を発見した。 D + Q を繰り返し経口投与すると、これらの細胞の数が減少し、根の吸収が著しく減少しました。これらの結果は、機械的ストレスによって誘発される老化が根の吸収において重要な役割を果たしており、老化細胞破壊療法で予防可能であることを示しています。

この研究では、L ループを使用してラットの左上顎 M1 に垂直力と機械的ストレスを誘導することに成功しました (図 1)。 OTM は、弾性チェーン 49 を使用した水平歯の移動モデル 49、密閉コイルスプリング 50、クワッドヘリックス型器具 51 など、いくつかの実験モデルを使用した多くの研究で模倣されてきました。52 しかし、これらの実験モデルは主に、歯の水平移動。一方、歯科矯正治療では貫入力を発生させる垂直歯の移動がよく使用されるにもかかわらず、歯根先端での歯根吸収を誘発する貫入歯の移動モデルの開発を試みた研究はわずか52,53である。歯を垂直に動かす場合、根尖根と歯周組織は高い機械的ストレスを受け、歯根吸収のリスクが高まります54,55。一時的な歯根吸収とそれに続くセメント質修復の後56、歯根先端は徐々に平らになり、完全にはその長さを取り戻しません57。その結果、根尖根吸収は側根吸収よりも重症度が高い58。その結果、我々は根尖根吸収の根底にあるメカニズムを解明するための貴重なプラットフォームであることが証明された貫入歯の移動モデルを作成した。弊社で用意したモデルはステンレスワイヤーだけで歯にループをセットするのが簡単です。一方、Lループの形状を整えるには矯正の技術が必要です。

私たちのμ-CTおよび組織学的分析は、重度の根尖根の吸収がストレス5日目あたりから始まっていることを示しました（図2a、b）。興味深いことに、OTM を使用すると、根尖根の吸収が骨吸収よりも遅くなりました (図 2a)。さらに、ストレス3日目には、TRAP+象牙細胞よりも多くのTRAP+破骨細胞が歯槽骨に出現し始めた（図2b、d、e）。さまざまな研究者が in vivo および in vitro で象細胞と破骨細胞を研究していますが 59、in vivo でのこれら 2 つの細胞型の形成の違いは完全に不明のままです。以前の研究では、機械的に刺激されたセメント芽細胞は骨芽細胞よりもRANKLの発現が少ないことが報告されており10、機械的刺激に対する感受性はセメント芽細胞と骨細胞で異なる60。さらに、単球（象牙細胞と破骨細胞の起源）が存在する骨髄からの距離は、根尖吸収と骨吸収の間のタイムラグに部分的に関連している可能性があります。

p21 と p16 は重要な老化関連マーカーですが、その発現動態は異なります 61。私たちの研究では、垂直方向の機械的ストレスを受けた根尖周囲組織では、p21+ 細胞が p16+ 細胞よりも早く出現しました (図 3、4、および 5)。以前の研究では、p21 発現の増加は細胞老化に達すると劇的に減少するのに対し、p16 発現増加は一定期間継続し、その後細胞寿命の終わりと分化の始まりに増加することが報告されています 47。は早期老化マーカーであり、p16 は後期老化マーカーです。 47 さらに、より最近の報告では、機械的ストレスによって刺激されたセメント芽細胞が、標的遺伝子の翻訳を抑制することによってアポトーシスと細胞増殖を制御する重要な因子である lincRNA-p21,27 を発現することが示されています。 p53 シグナル伝達経路 62 (p21 発現を調節する主要な経路 61)。私たちの研究では、3日目からp21がp16よりも一貫して高度に発現していたことを考えると、私たちのデータは、OTM誘発の機械的ストレスによっても、生体内であってもp21からp16の順序で老化細胞が生じるという証拠を提供します（図5）。

これまでの研究では、セメント芽細胞と PDL 細胞が in vitro での機械的ストレス刺激下で RANKL を生成する可能性があることが示されています 12,16。 RANKL の高い発現は、単球マクロファージ系統の細胞から前象牙細胞への変換を促進し、根の吸収活性を高めます。 3 私たちの研究では、 RANKL+非老化（p21-）細胞とRANKL+老化（p21+）細胞の数はストレス5日目までは差がありませんでしたが、ストレス7日目からは顕著な違いが観察されました（図6d、7d）。これらの結果は、RANKL+ 非老化細胞および RANKL+ 老化細胞が歯細胞形成の開始に寄与していることを示唆しています。しかし、後者はおそらくこの形成の悪化または成熟において重要な役割を果たしています。実際、老化細胞破壊（D + Q）を使用して老化細胞を除去することにより、ほとんどのTRAPおよびカテプシンK +象牙細胞を除去しました（図9d、f、およびS6）。

D + Q投与により、RANKL+、p21+、および/またはp16+細胞の数が大幅に減少し、根の吸収阻害が引き起こされました（図9a〜f）。ダサチニブは、骨髄間質細胞における RANKL 発現 63 および破骨細胞形成を阻害することが知られており 64,65、この薬剤は老化セメント芽細胞からの RANKL 発現と、前象歯細胞からの PDL および象牙細胞形成を直接阻害する可能性があります。一方、以前の研究では、機械的刺激が細胞の ROS66 および炎症性サイトカインの分泌を促進することが示されています 67。これらのパラクリン因子は DNA 損傷を引き起こし、細胞老化を誘導する可能性があります 68。さらに、外因性 ROS に曝露された単球マクロファージ系統の細胞は、RANKL シグナル伝達カスケードを活性化し、対照的に、D + Q 成分であるケルセチンには、抗酸化作用と抗炎症作用があります。38 したがって、D + Q 処理は、非老化細胞が炎症性物質または ROS を生成するのを抑制し、破骨細胞の形成を防ぐ可能性があります。細胞死を引き起こすことなく老化細胞を誘導し、RANKLシグナル伝達を活性化します。しかし、ストレス1日目と7日目にD+Qを投与したところ、ストレス14日目には根尖周囲組織のCAP+細胞の総数も減少しました（図9c）。 TUNEL+ 細胞は 8 日目に増加しました (図 S4)。したがって、D + Q には、初期段階での細胞老化の誘導を阻害し、RANKL+ 老化細胞の細胞死を引き起こし、前歯細胞細胞からの象牙細胞形成を阻害して後期段階での根の吸収を防ぐなど、さまざまな機能があると考えられます。

以前の研究では、RANKL 刺激が破骨細胞形成中に p21 発現を引き起こすことが報告されています 70。したがって、象牙細胞が p21 発現のみから細胞老化を受けるかどうかを結論付けることはできません。しかし、この研究では、根の吸収窩中に限られた数のカテプシンK + p21 + p16 + 多核細胞が見つかりました（図8）。これは、老化した象牙細胞が機械的ストレス刺激下で存在することを示唆しています。老化象牙細胞様細胞と他の象牙細胞との機能的な違いは現時点では不明であるが、根尖吸収の一部の症例は 25 年間回復できなかった 71。アポトーシスを回避する老化細胞の特徴を考慮すると、老化象牙細胞は長期間生存し、歯根吸収の重症化に寄与します。

この研究では、OTM によって誘導される機械的ストレス誘発老化細胞が根の吸収に寄与することを実証しました。しかし、老化細胞、歯細胞形成、歯根吸収の関係の根底にあるメカニズムを探るには、さらなる詳細な検査が不可欠です。たとえば、根の吸収中のRANKL+老化細胞と象牙細胞の数の間には不一致があります（他の細胞、分子などが象牙細胞の形成に寄与している可能性があります）。老化細胞と根の吸収との長期的な関連性は依然として不明である。さらに、ヒトとラットでの結果を慎重に比較する必要があります。異なる投与間隔、期間、濃度などの他の条件によっては、異なる結果が生じる可能性があります。副作用を回避するために、どの老化細胞破壊薬剤が臨床使用に適用できるかを検証するには、さらなる調査が不可欠です。重要なことは、我々の研究では、インビトロアッセイを使用した機械的ストレス下での細胞老化によって誘導されるRANKL発現と象牙細胞形成との間の詳細な分子機構を解明できなかったが、これらのデータは老化細胞と象牙細胞形成との関連を強化するであろうということである。メカニズムを詳細に解明する必要がある。しかし、私たちの知る限り、これは機械的ストレス誘発性老化セメント芽細胞または PDL 細胞が生体内での根の吸収機構において重要な役割を果たしていることを実証した最初の研究です。この研究で使用された代表的な老化細胞破壊薬は、歯胚芽細胞形成と根の吸収を防止しました。さらに、歯列矯正による歯の移動中の根尖周囲組織における老化細胞と象牙細胞の時空間分布が明らかになりました。これらの発見は、歯列矯正治療が始まって以来、臨床医にとって長年の懸案であった歯根吸収の新たな予防および治療法の開発に新たな洞察をもたらす可能性がある。

まず、0.014 インチのステンレス鋼ワイヤ (米国カリフォルニア州ブレア、Ormco Corp.) をライトワイヤプライヤーで曲げました (図 1a、b はそれぞれ初期形状と活性化形状を示しています)。デザインは臨床矯正治療で一般的に使用されるLループモチーフに基づいています。具体的な設計基準は次のとおりです。(1) L ループは、初期形状のループの遠心線とループの近心線の間に 1 mm の垂直ステップで作成され、(2) L ループは遠心線を近心線と同じ高さまで押し下げます。活性化時の垂直力は 5 N であった。L ループの安定性を確認するため、大阪歯科大学生体材料研究部の万能試験機装置を用いて実験に使用した L ループの活性化状態での垂直試験力を測定した。大学。同じ実験者が 3 回測定を繰り返し、OTM モデルとして平均試験力 5 N を取得しました。

この動物実験は大阪歯科大学の地域倫理委員会によって承認され、関連する方針が厳格に遵守されました（承認番号：22-02031）。実験に影響を与える加齢に伴う老化細胞の生成を避けるため、体重400～450gのSprague Dawleyラット（雄、15週齢）を実験群として使用した。すべてのラットは SHIMIZU Laboratory Supplies (京都、日本) から購入しました。 OTM モデルは図 1a、b に示すように当てはめられました。 3種類の麻酔薬（酒石酸ブトルファノール：2.5mg・kg-1、ミダゾラム：2mg・kg-1、塩酸メデトミジン：0.15mg・kg-1）を混合した全身麻酔後、ラットにLループを設置した。 ' 左 M1 (図 1b)。第 2 と第 3 臼歯の咬合面のワイヤーは装着時に垂直に押し下げられ、M2 と M3 の咬合面の遠位部分にレジン (クラレノリタケ、新潟県) を使用してワイヤーを固定しました。次に、L ループを作動させ、M1 咬合面に 5 N の力を加えました。 32 匹のラットを次のように分けて使用しました (1 グループあたり 4 匹のラット、図 1c): 1. 無処置グループ (対照): 14 日後に安楽死。 2. 実験群: L ループ設置後 0、3、5、7、14 日目に安楽死させた。 3. 8d+D+Q および 14d+D+Q グループ：L ループ装着後 1 日目と 7 日目に D+Q 老化細胞破壊薬を投与し、8 日目または 14 日目に安楽死させた。

OTM と歯根吸収の形態を観察するために、ラット上顎骨サンプルを 85 kV の電圧、65 μA の電流、および高解像度でμ-CT (SkyScan 1275、Bruker Co.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国) でスキャンしました。 3D データは、SkyScan™ CT Analyzer ソフトウェア (バージョン 1.17.7.2) および Mimics (13.1 ソフトウェア Materialise、ルーベン、ベルギー) を使用して再構築されました。基準線は、ラットの左臼歯の近心尖と遠心尖の頬側に沿って引かれました（図1d）。 M1の近心尖から基準線までの垂直距離をOTMとみなした（図1d）。測定は、ImageJ (バージョン: 2.1.0、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国) を使用して実行されました。左上顎 M1 の近心根尖の平均 RMD も定量化されました。72

サンプルを 10% 中性ホルマリンで 24 時間固定しました。エチレンジアミン四酢酸（すなわち、EDTA）中性脱灰溶液 B（カタログ番号 LEP2494、富士フイルム和光純薬株式会社）中で 4 °C で 2 週間脱灰した後、歯をショ糖勾配で脱水しました。すべてのサンプルの凍結切片は、Kawamoto 法を使用して調製されました 73。クライオトーム (Leica CM3050S; Leica Biosystems、米国イリノイ州リッチモンド) を使用して、厚さ 10 µm の連続凍結切片が得られました。脱灰切片の HE 染色は、以前に報告された方法 48 に従って標準手順を使用して実行されました。TRAP 染色は、染色キット（カタログ番号 294-67001、富士フイルム和光純薬株式会社）を使用して実行され、象牙細胞と骨芽細胞を確認しました。画像は、BZ-9000 デジタル顕微鏡 (Keyence Corporation、大阪、日本) で撮影されました。

脱灰切片を 10% Antigen Retrieval Solution HistoVT One (カタログ番号 06380-76、ナカライテスク株式会社、京都、日本) で抗原活性化した後、5% ヤギ血清およびリン酸塩中の 0.3% Triton X-100 でブロックおよび透過処理しました。 -緩衝生理食塩水、それぞれ。次に、切片を一次抗体と結合させました。抗 p21 ポリクローナル抗体 ALEXA FLUOR® 555 (カタログ番号: bs-10129R-A555、Bioss Antibodies Inc、Woburn、MA、USA、1:100)、抗 p16 ポリクローナル抗体ALEXA FLUOR® 594 (カタログ番号: bs-23881R-A594、1:100)、抗 p16 ポリクローナル抗体 ALEXA FLUOR® 488 コンジュゲート (カタログ番号: bs-23881R-A488、1:100)、抗RANKL ALEXA FLUOR® 647 コンジュゲート (カタログ番号: bs-20646R-A647、1:100)、抗カテプシン K ALEXA FLUOR® 647 コンジュゲート (カタログ番号: SC-48353 AF647、Santa Cruz Biotechnology. Inc, California) 、米国、1:100）、抗セメント付着タンパク質（3G9）ALEXA FLUOR® 488 コンジュゲート（カタログ番号：SC-53947 AF488、1:100）、抗 Ki67 ALEXA FLUOR® 488 コンジュゲート（カタログ番号： .: 118825、Cell Signaling Technology, Inc.、米国マサチューセッツ州ビバリー、1:100）。切片を 4 °C で一晩インキュベートし、DAPI-Fluoromount-G® でマウントしました。次に、それらをレーザー共焦点顕微鏡 (LSM-700、Zeiss-Microscopy、イエナ、ドイツ) で観察しました。

上記の TUNEL 染色試薬はすべて、CF™ Dye TUNEL Assay Kits ALEXA FLUOR® 647 (カタログ番号 30074、Fermont、CA、Biotium, Inc.) から入手しました。すべての切片をキットのプロトコールに従って染色し、DAPI-Fluoromount-G® でマウントしました。すべての切片をレーザー共焦点顕微鏡 (LSM-700、Zeiss-Microscopy、イエナ、ドイツ) で観察しました。

定量的な TRAP、TUNEL 染色、および免疫蛍光染色分析は次のように計算されました。各切片の関心領域 (ROI) は、10 倍 (TRAP 染色) または 20 倍 (TUNEL および免疫蛍光染色) の視野の下で分析されました。次に、歯根端の境界線上のセメント質細胞の層が、セクションごとの歯根表面の ROI として選択されました。境界線上の細胞外層から歯槽骨表面までの範囲をＰＤＬ領域のＲＯＩとした。 ImageJ (バージョン: 2.1.0、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州) を使用して ROI 内の TRAP 陽性細胞の数を数え、Fiji2 (バージョン: 1.0、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国）ROI 内の TUNEL 陽性および免疫蛍光多重染色陽性細胞の数をカウントします。 4 匹のラット (n = 4) からの 4 つのサンプルをテストしました。各ラットは独立した実験を受けました。

PEG-200溶液は、ポリエチレングリコール200（PEG-200、カタログ番号：ESL3444、富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）をMillQに溶解することによって調製した。ダサチニブ (カタログ番号: 11498、Cayman Chemical Co.、米国ミシガン州アナーバー) とケルセチン (カタログ番号: sc-206089A、SCB Santa Cruz Biotechnology Inc.、米国テキサス州ダラス) を上記で調製したPEG-200溶液を完全に混合して老化細胞破壊薬を作成します。ストレス後群の各ラットに、L ループ設置後 1 日目と 7 日目に、それぞれ 6.67 mg・kg-1 (D) および 66.7 mg・kg-1 (Q) の老化細胞破壊薬を経口投与しました。

すべてのデータは、Prism 8 (GraphPad Software Co.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用して統計的に分析されました。すべての結果は平均±標準偏差として表されました。スチューデントの t 検定を 2 つのグループ間の比較に使用しました。 5 つのグループ間の比較に対して、一元配置分散分析とそれに続く Tukey 多重比較事後検定を実行しました。 <0.05 の P 値は統計的に有意であるとみなされました。

この研究に関連するすべてのデータは論文に記載されています。

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動物実験についてアドバイスをいただいた Ye Zhang、Yuzhu Sun (大阪歯科大学生体材料学教室)、Jianxin Zhao、中本吉継、宮地洋介、的場博志 (大阪歯科大学矯正歯科教室)、および吉田啓太 (麻酔科) に感謝します。、大阪歯科大学）と平井雄也氏（大阪歯科大学生物学科）に免疫蛍光染色のサポートをしていただきました。この研究は、JST、CREST 助成金番号 JPMJCR22L5、日本の支援を受けました。

大阪歯科大学矯正歯科教室大阪府枚方市葛葉花園町8-1

Yue Zhou, Aki Nishiura, Hidetoshi Morikuni, Wenqi Deng & Naoyuki Matsumoto

大阪歯科大学物理学教室, 大阪府枚方市葛葉花園町8-1

Toru Tsujibayashi

大阪歯科大学麻酔科大阪府枚方市葛葉花園町8-1

Yoshihiro Momota

東京都品川区旗の台1-5-8 昭和大学歯学部薬理学教室

Yuki Azetsu & Masamichi Takami

大阪歯科大学口腔解剖学教室、大阪府枚方市葛葉花園町8-1

Yoshitomo Honda

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AN、YH、YZ が研究を考案し、設計しました。 YZ、WD、ANが実験を行いました。 YZ、AN、YA、MT、YH がデータを分析しました。 YHさん、YZさん、ANさんが草稿と原稿を書きました。 HM、TT、YM、YA、MT、NM の改訂論文。 AN と YH が研究を監督しました。著者全員が論文の最終版を承認しました。

Correspondence to Aki Nishiura or Yoshitomo Honda.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

周裕也、西浦明、森国博ほか機械的ストレス下にあるRANKL+老化細胞：老化細胞破壊を用いた歯科矯正の歯根吸収の治療標的。 Int J Oral Sci 15、20 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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受信日: 2022 年 10 月 15 日

改訂日: 2023 年 4 月 29 日

受理日: 2023 年 5 月 4 日

公開日: 2023 年 5 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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